A genetikai vizsgálatok során gyakran találkozunk elégtelen RNS mintákkal, például apró anatómiai szájtumorok, akár egysejtes minták, illetve olyan specifikus génmutációk mintáinak vizsgálatához, amelyek nagyon alacsony szinten íródnak át emberi sejtekben.Természetesen a COVID-19 teszthez, ha a mintavétel során nem a megfelelő helyen vannak a tamponok, vagy nem kell elégszer, a minta mérete nagyon alacsony lesz, ezért két napja jelent meg az Egészségügyi és Családtervezési Bizottság, átment a teszten, és ha a nukleinsav mintavevő nem vett hat mintát, akkor jelentheti.
A reagens érzékenysége azért fontos, mert ilyen vagy olyan problémánk van, tehát mit tehetünk az RT-PCR érzékenységének javítása érdekében?
Mielőtt a lehetséges megoldásokról beszélnénk, említsünk meg két nagy bonyodalmat az imént említett helyzettel kapcsolatban.
Először is aggódunk az RNS elvesztése miatt, amikor csak néhány sejtpopuláció van a mintánkban.Ha hagyományos elválasztási és tisztítási módszereket, például oszlopos módszert vagy nukleinsavas kicsapási módszert alkalmaznak, nagy a valószínűsége annak, hogy a kevés minta elveszik.Az egyik megoldás egy hordozó molekula, például tRNS hozzáadása, de még ekkor sem garantálható, hogy a helyreállítási kísérletünk rendben van.
Szóval mi a jobb módszer?Tenyésztett sejtekhez vagy mikroanatómiai mintákhoz jó lehetőség a közvetlen lízis alkalmazása.
Az ötlet az, hogy a sejteket 5 percre felhasítjuk, az RNS-t az oldatba engedjük, majd 2 percre leállítjuk a reakciót, majd a lizátumot közvetlenül a reverz transzkripciós reakcióhoz adjuk, hogy az RNS ne vesszen el, végül a kapott cDNS-t közvetlenül adjuk. a valós idejű reakcióba.
De mi van akkor, ha egy korlátozott kiindulási pont vagy egy kis mennyiségű célgénexpresszió miatt az összes RNS-t újrahasznosíthatjuk, és mégsem biztosítunk elegendő templátot a jó valós idejű jelhez?
Ebben az esetben az előerősítő lépés nagyon hasznos lehet.
A következő séma a fordított átírás utáni érzékenység növelésére szolgál.Mielőtt elkezdené, meg kell kérdeznünk, hogy melyik célpontok érdekelnek bennünket, hogy ezekhez a célpontokhoz specifikus primereket tervezzünk az előerősítéshez.
Ez úgy érhető el, hogy akár 100 pár primert és 10-14-szeres reakcióciklust tartalmazó vegyes alapozót hozunk létre.Ezért egy kifejezetten erre a követelményre tervezett Master Mixre van szükség a kapott cDNS előamplifikálásához.
A ciklusok számának 10 és 14 közötti beállításának oka, hogy ez a korlátozott ciklusszám biztosítja a véletlenszerűséget a különböző célpontok között, ami döntő fontosságú azon kutatók számára, akiknek kvantitatív molekuláris információra van szükségük.
Az előamplifikáció után nagy mennyiségű cDNS-hez juthatunk, így a háttérben a detektálási érzékenység nagymértékben javul, sőt a minta hígításával és több valós idejű PCR reakcióval is kiküszöbölhetjük az esetleges véletlenszerű hibákat.
Feladás időpontja: 2023.04.11